I. MỤC ĐÍCH

Mô tả quy trình cho nhân viên khoa Vi sinh về kỹ thuật nuôi cấy và định danh vi nấm

II. PHẠM VI ÁP DỤNG

Quy trình này áp dụng để cho mọi nhân viên khoa Vi sinh, Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh.

III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN

- Kỹ thuật xét nghiệm Vi sinh lâm sàng (Nhà xuất bản Y học, 2006)

IV. TRÁCH NHIỆM

Nhân viên xét nghiệm khoa vi sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh có trách nhiệm thực hiện theo đúng quy trình

Người thực hiện: cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên nghành vi sinh, làm việc tại khoa Vi sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh

V.ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

Giải thích thuật ngữ:

- Không áp dụng

Từ viết tắt:

- SOP     =          Quy trình chuẩn (Standard of Procedure)

- KXN   =          Khoa Xét nghiệm

VI. NGUYÊN LÝ

Vi nấm được định danh dựa vào đặc điểm nuôi cấy, một số tính chất chuyển hóa, các đặc điểm về hình thái học và có thể kết hợp với tính chất kháng nguyên.

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

7.1. Trang thiết bị

-  Kính hiển vi.

-  Tủ an toàn sinh học cấp 2

-  Máy ly tâm.

-  Tủ ấm.

-  Máy tính cài phần mềm đọc API ( nếu có).

7.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

- Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao

- Lấy lọ bệnh phẩm

- Que cấy

- Lam kính

- Lá kính

- Lactophenol Coton Blue

- Nước muối sinh lý

- KOH 20 %

- Mực tàu

- Sabouraud

- Candiselect

- Giá đường API

- RAT

- Bông

- Cồn 90 độ (vệ sinh dụng cụ)

- Đèn cồn

- Panh

- Khay đựng bệnh phẩm

- Hộp vận chuyển bệnh phẩm

- Mũ

- Khẩu trang

- Găng tay

- Găng tay xử lý dụng cụ

- Quần áo bảo hộ

- Acid ngâm lam

- Ống nghiệm thủy tinh

- Bút viết kính

- Bút bi

- Bật lửa

- Sổ lưu kết quả xét nghiệm

- Cồn sát trùng tay nhanh

- Dung dịch nước rửa tay

- Khăn lau tay

- QC (nếu thực hiện)

- EQAS (nếu thực hiện

* Ghi chú: 

- Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với

số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).

- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

VIII. NỘI DUNG

8.1 Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh

8.2. Tiến hành kỹ thuật

Bước 1: Nuôi cấy nấm trên môi trường Sabouraud ủ ấm ở nhiệt độ 30°C.

            -  Bệnh phẩm là da, tóc, móng: Cắt nhỏ bệnh phẩm cấy 6 - 8 điểm trên đĩa Sabouraud.

            -  Bệnh phẩm là các chất dịch: Hút 3 -  5 giọt dịch cấy dàn trên đĩa  Sabouraud.

            -  Bệnh phẩm là nước tiểu: Sử dụng kỹ thuật cấy định lượng.

Bước 2: Soi tươi tìm nấm

            Đánh giá sơ bộ hình thái khuẩn lạc, dạng khuẩn lạc

Bước 3: Đọc kết quả hàng ngày

IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

-  Quan sát hình thể cấu tạo, tính chất, màu sắc khuẩn lạc.

    +   Khuẩn lạc nấm men: 

            Khuẩn lạc Candida có dạng trơn, nhẵn màu kem thường mọc nhanh sau 24 giờ.

             Khuẩn lạc Cryptococcus trơn nhẵn màu be (khô hơn so với nấm Candida) mọc

chậm thường  sau 48 giờ.

    +   Khuẩn lạc nấm mốc:

            Aspergillus màu sắc khuẩn lạc khác nhau.

            P. marneffei: sinh sắc tố màu đỏ nâu đến đỏ rượu vang khuếch tán vào môi trường khi nuôi cấy ở nhiệt độ phòng.

- Quan sát kính hiển vi sau cấy: 

            Tế bào nấm men hình tròn hoặc bầu dục (đối với nấm Candida), nẩy chồi hoặc không. Cryptococcus thường hình tròn, kích thước lớn. 

-  Định danh loài nấm men

            + Định danh sơ bộ  4 loài nấm men  tiến hành nuôi cấy vào môi trường Candida select.

            + Định danh nấm men bằng bộ API 20C AUX.

            + Trả kết quả  loài nấm theo kết quả định danh.

-  Định danh nấm mốc

            Làm tiêu bản bằng Lactophenol Coton Blue.

            Dựa vào hình thái, màu sắc khuẩn lạc, dựa vào đặc điểm vi thể của từng loài Aspergillus để kết luận loài. P. marneffei: Trên môi trường Sabouraud khuẩn lạc mọc nhanh, kiểu da lộn cho đến có dạng phủ đầy lông tơ, sinh sắc tố màu đỏ nâu đến đỏ rượu vang khuếch tán vào môi trường.

- Không thấy khuẩn lạc mọc sau 4 ngày trả kết quả sơ bộ: Âm tính.

- Các đĩa cấy được bỏ sau 7 ngày nuôi cấy.

X. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Kiểm tra môi trường theo QC với các chủng vi khuẩn ATCC.

- Các hoá chất để định loại vi khuẩn phải được kiểm tra chất lượng hàng tuần

XI. AN TOÀN

- Phải cẩn thận khi tay tiếp xúc với mẫu bệnh phẩm và thực hiện đúng qui trình.

- Xử lý tất cả các bệnh phẩm như là nguồn lây nhiễm.

XII. HỒ SƠ LƯU

Để  định danh nấm men bằng bộ API 20C AUX  cho kết quả chính xác

khi lấy khuẩn lạc nấm phải thuần (khuẩn lạc riêng rẽ) tránh bị lẫn.

XIII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

- Không áp dụng