I      MỤC ĐÍCH

Mô tả quy trình hướng dẫn cho cán bộ phòng nuôi cấy quy trình nuôi cấy để  phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh từ đờm và dịch rửa phế quản.

II     PHẠM VI ÁP DỤNG

Quy trình này áp dụng cho các nhân viên phòng nuôi cấy, khoa Vi sinh, Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh.

III     TÀI LIỆU VIỆN DẪN

• Diagnostic Microbiology-4^th Edition-Washington, Philadelphia
• Bergey^’s Manual of Determinative Bacteriology-9^thEdition-William&Wilkins.
• Manual of Clinical Microbiology-8^thEdition-WashingtonDC-Patrick R.Murray.
• Kỹ thuật xét nghiệm Vi sinh lâm sàng (Nhà xuất bản Y học, 2006)

IV. TRÁCH NHIỆM

• Nhân viên xét nghiệm khoa vi sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh có trách nhiệm thực hiện theo đúng quy trình
• Người thực hiện: cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên nghành vi sinh, làm việc tại khoa Vi sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh

V.ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

 Giải thích thuật ngữ

• Không áp dụng

Từ viết tắt

• SOP     =          Quy trình chuẩn (Standard of Procedure)
• KXN   =          Khoa Xét nghiệm
• BAL  =           Dịch rửa phế quản
• IS      =            Đờm
• MC   =            Thạch MacConkey
• BA    =            Thạch máu
• CA    =            Chocolate Agar: Thach sô cô la

VI. NGUYÊN LÝ

Bệnh phẩm được cấy trên môi trường phù hợp, ở điều kiện thích hợp giúp tăng sinh vi khuẩn từ đó lựa chọn vi khuẩn có khả năng gây bệnh. Cấy đờm bán định lượng giúp cho việc trả kết quả vi khuẩn gây bệnh chính xác hơn.

VII. TRANG THIẾT BỊ VÀ VẬT TƯ

Thiết bị

• Tủ an toàn sinh học
• Tủ ấm Memmert
• Tủ ấm CO₂

• Kính hiển vi

Dụng cụ

• Dầu soi
• Que cấy
• Giá đỡ

• Đèn cồn

Hóa chất, thuốc thử

• Thạch MacConkey (MC)
• Thạch Máu (BA)

-     Thạch sô cô la

-     Đối với các vi khuẩn khác nhau thì cần môi trường khác nhau

-     Các hoá chất, sinh vật phẩm để thử các vi khuẩn

-     Bộ thuốc nhuộm Gram

VIII. NỘI DUNG

Bệnh phẩm

• Đờm khạc, đờm lấy từ bẫy đờm ở những bệnh nhân không tự khạc được, dịch rửa phế quản
• Bệnh phẩm đờm phải không lẫn nước bọt. Các bệnh phẩm phải đủ số lượng, lọ đựng bệnh phẩm phải có nắp đậy chặt, có đầy đủ thông tin đi kèm.

Nhuộm Gram

• Tất cả mẫu đờm phải được sàng lọc bằng nhuộm Gram để chắc chắn mẫu đạt tiêu chuẩn và nhận định sơ bộ hình thể vi khuẩn trong đó.
• Soi ở vật kính 10x để đếm số lượng bạch cầu, tế bào biểu mô (lặp lại ít nhất 10 vi trường)

+ Nếu < 25 bạch cầu hoặc > 10 tế bào biểu mô/1 vi trường: bệnh phẩm không đạt tiêu chuẩn, loại bỏ bệnh phẩm đó và báo lâm sàng lấy lại bệnh phẩm

+ Nếu ≥ 25 bạch cầu và ≤ 10 tế bào biểu mô/1 vi trường: bệnh phẩm đạt tiêu chuẩn, soi tiêu bản ở vật kính dầu để nhận định sơ bộ hình thể vi khuẩn, tiến hành nuôi cấy.

• Đối với dịch rửa phế quản, chắt 1,5 – 2 ml dịch đem ly tâm với tốc độ 1200 vòng/10 phút, bỏ nước nổi, lấy cặn nhuộm Gram và nuôi cấy.

Nuôi cấy

• Đối với đờm: cấy đồng thời trên cả 3 đĩa: thạch máu, sô cô la, MAC.

+  Dùng que cấy lấy 1 lượng đờm cấy nguyên ủy trên 3 đĩa thạch, rồi đốt que cấy và cấy phân vùng thành 4 vùng. Sau mỗi một vùng cấy đều phải đốt que cấy.

+  Để đĩa thạch máu và sô cô la vào tủ ấm CO₂, đĩa MAC vào tủ ấm thường.

• Đối với dịch rửa phế quản: dùng que cấy lấy cặn cấy vào 1 đĩa thạch máu, 1 đĩa sô cô la.
• Đọc kết quả ở những ngày sau đó.

IX. DIỄN GIẢI KẾT QUẢ

• Sau khi ủ ấm 18 – 24 h, đọc kết quả và định danh vi khuẩn theo thường quy.
• Báo cáo kết quả theo số lượng vi khuẩn trong bệnh phẩm đờm:

+ Nếu vi khuẩn mọc tốt ở vùng 1 và < 5 khuẩn lạc ở vùng 2: báo cáo kết quả số lượng vi khuẩn 1+.

+ Nếu vi khuẩn mọc tốt ở vùng 2 và < 5 khuẩn lạc ở vùng 3: báo cáo kết quả số lượng vi khuẩn  2+.

+ Nếu vi khuẩn mọc tốt ở vùng 3 và < 5 khuẩn lạc ở vùng 4: báo cáo kết quả số lượng vi khuẩn 3+.

+ Nếu vi khuẩn mọc tốt ở vùng 4: báo cáo kết quả số lượng vi khuẩn 4 +.

+ Lưu ý: số lượng vi khuẩn tính riêng cho mỗi loại, không bao gồm những vi khuẩn khác trên đĩa thạch. Báo cáo cả số lượng vi khuẩn thuộc vi hệ.

X. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

• Kiểm tra môi trường theo QC với các chủng vi khuẩn ATCC.
• Các hoá chất để định loại vi khuẩn phải được kiểm tra chất lượng hàng tuần.

XI. AN TOÀN

• Phải cẩn thận khi tay tiếp xúc với mẫu bệnh phẩm và thực hiện đúng qui trình.
• Xử lý tất cả các bệnh phẩm như là nguồn lây nhiễm.

XII. HỒ SƠ LƯU

• Không áp dụng

XIII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN

Không áp dụng